一,实验原理
在实验动物组织病理学实验研究中，特别是进行原位杂交和免疫组化研究，为避免或减少死后组织形态及结构发生变化，常于动物处死前，采用灌注固定法。灌注固定即通过血管途径将固定液导入所需固定的组织器官内，将活的细胞在原位及时迅速固定，再摘取样品。
心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死之前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变,从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。
二,实验前准备
实验器具: 剪刀1把，眼科剪1把，镊子1把，0.5ml的注射器1个，大头针4个 (可用针头替代)，解剖板1个，止血钳2把，灌注机1整套，止血夹1个，断头台1个，离心管1支，废液缸1个，水合氯醛1瓶，生理盐水1瓶，4%多聚甲醛1瓶。
三,实验步骤
1、老鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上(用针头插住四肢)。用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨，暴露出心脏和肝脏。
2、将注射针头插入老鼠左心室，同时将老鼠肝脏剪掉，以使血液流出。灌注生理盐水，时间维持在 1分钟 (10~20ml) 灌注液左右，血液排除后,四肢、肝脏和舌头会变白。
3、待老鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，用 4%PFA 灌流固定,当 PFA 流至大脑处可能会使老鼠尾巴略有反射现象(有时可能没有)，此时可将灌流速度下调，以使固定更加充分。整个 PFA 灌流时间约为 5min。(固定原理: 多聚甲醛可以使蛋白质交联)
4、将导管始端从 PFA 中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现老鼠眼球呈现白色。将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取其他组织的操作。
四,常见问题
1.没有灌注固定取材的组织能不能做切片和免疫荧光/组化染色？
答:如果没有灌注固定，而是直接取材然后放固定液中可以进行组化/荧光染色，但是效果没有灌注固定的效果好。
2.组织取材固定了几个月了,对组化/荧光实验有无影响?
答:固定时间过长组织样本,蛋白多肽链交联在一起,抗原性变弱，很可能没有阳性结果，当组织抗原比较低时就很难把抗原性修复。所以组织固定时间长，就应该调整抗原修复时间或修复条件。
3,多聚甲醛灌注过的组织是否可以用于Western blot及PCR实验检测?
答:多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变,所以如果做后续取材做Western blot及PCR检测不建议多聚甲醛灌注,可以适当使用生理盐水或含酶抑制剂或RNA保护剂的短暂灌注.或者分两组动物进行实验：一组灌注固定（用于形态学），另一组不灌注（直接取材做WB/PCR）.
