Nature子刊：小鼠背部皮肤伤口模型构建的可重复策略

在探索皮肤修复和再生领域，伤口愈合实验是不可或缺的一环。发表在《Nature Protocols》杂志上的研究论文由Yampolsky M, Bachelet I, Fuchs Y合著，题为《Reproducible strategy for excisional skin-wound-healing studies in mice》（小鼠切除性皮肤伤口愈合研究的可重复策略），详细展示了一个标准化的实验流程，旨在提高小鼠皮肤伤口愈合实验的可重复性和可靠性。该文献不仅是实验生物学者的宝贵资源，也为临床研究提供了实验数据，有助于未来治疗策略的开发。让我们一起深入了解这项研究的细节与应用。（文章末尾有伤口建模详细流程图）

• 皮肤作为哺乳动物生物学中的研究重点，其研究领域覆盖广泛，包括但不限于干细胞生物学、命运转变、皮肤免疫系统的互动、细胞通信、衰老、表观遗传记忆以及创伤后肿瘤的形成等。其中，伤口愈合（WH）实验作为一项基础研究手段，对于评估各种因素如药物治疗、基因修饰和环境条件等对皮肤修复过程的影响至关重要。

• 伤口愈合实验主要通过在小鼠背部皮肤上进行全层切除，然后定期测量伤口大小来监测修复过程。尽管此类实验已被广泛使用，但特定的实验技术和操作细节对于确保实验结果的可靠性和重复性至关重要。

• 文中提供了一套全面的操作方案，旨在帮助研究人员设计和执行伤口愈合实验，从实验设计到结果分析的每个环节都进行了详细说明。特别强调了那些关键的技术方面，忽视它们可能会导致数据混乱，从而产生假阴性或假阳性结果。此外，还讨论了将伤口愈合实验与谱系追踪实验相结合使用的可能性，以及进行综合性皮肤分析的方法。

• 通过遵循此方案，研究人员可以提高实验的可靠性和重复性，为研究皮肤的生理和病理提供准确的数据支持。这不仅促进了皮肤科学的发展，也为临床治疗提供了理论基础和实验依据。

关键点

• 该研究提供了一种在小鼠背部皮肤中进行全层切除伤口愈合（WH）测定的准确方法，具有高重现性。

• 该方法可以通过减少偏差和提高可靠性来改进伤口愈合研究，最终减少每次实验所需的动物数量。此外，该测定可以与谱系追踪实验相结合，以研究不同细胞群对修复过程的贡献。

图 1| 皮肤伤口愈合的经典模型：a.小鼠的背部皮肤可大致分为吻侧（朝向头部）和尾侧（朝向尾部）区域。在喙区，可以观察到脊椎的隆起（Bg）。b.受伤通常发生在隆起处、侧面或尾部的尾部区域，显示了尾部伤口的两种变体：一种是用3毫米活检打孔器产生的圆形伤口，另一种是通常用手术刀产生的方形伤口 (3×10mm²)。

方法应用

• 在WH实验中，实验的各个方面都可以提供生物信息。该测定的一个主要结果是确定愈合动力学。这可以通过在受伤后的特定时间点测量伤口的大小来确定实验组是否比对照组愈合得更快或更慢来实现。

• 除了伤口大小外，还可以详细观察其他宏观观察结果，例如伤口形状和颜色。通过在伤口完全密封（新表皮完全形成）之前处死动物，可以收获受伤组织用于分子分析，包括RNA和蛋白质提取、组织切片（例如用于免疫荧光、免疫组织化学、组织学染色和激光捕获）,显微解剖）和其他目的。

• 通过将这些分析与高通量组学和空间转录组学相结合，可以确定参与愈合过程的多种机制和细胞群。

• 受伤后对组织的检查至关重要，因为它可以揭示疤痕的各个物理方面，例如疤痕的特征、无疤皮肤再生的潜力、毛囊 (HF) 的重建以及愈合的其他末期阶段过程。

局限性

• 尽管小鼠背侧切除 WH 测定可作为探索哺乳动物伤口愈合的综合模型，但认识到小鼠和人类 WH 过程之间存在实质性差异是关键。小鼠表现出加速伤口闭合，因为它们在愈合过程早期收缩伤口的能力增强。这一特征主要归因于它们的皮肤松弛，比人类皮肤更容易收缩。

• 此外，小鼠真皮中的一层平滑肌（称为肉膜）支持伤口收缩，而人类皮肤大多缺乏这种功能。相反，人类表现出更长的炎症期和更长的以肉芽组织形成为特征的增殖期。肉芽组织阶段涉及成纤维细胞、巨噬细胞和粒细胞的浸润，从而形成促进伤口闭合和新血管形成的增殖中枢。

• 尽管这些过程在小鼠 WH 过程中自然发生，但由于强烈的收缩，它们在伤口闭合中发挥的作用较小。因此，为了更好地模拟人类伤口愈合的 WH 场景，研究人员可能会考虑限制收缩、有利于上皮再生和促进肉芽组织形成的伤口模型，例如尾部伤口或夹板伤口。

• 值得注意的是，除了组织重塑方面的差异外，临床上愈合伤口的治疗还涉及伤口敷料的应用等基本策略。早期研究表明，伤口敷料可以促进增殖并加速修复。在小鼠中，夹板伤口模型中经常报道伤口敷料，以防止夹板的自我或笼配合干预。然而，无器械切除伤口的包扎并不常见，并且伤口可以“自然”愈合。除了改变伤口愈合的性质之外，伤口敷料的应用还需要动物麻醉，既费力又使整个过程复杂化。因此，建议研究人员避免对无装置切除背部伤口进行此手术，并且此研究中不包括伤口敷料。

实验设计|

动物的数量、年龄和性别

• 应使用统计方法预先确定每个实验组中的小鼠数量。作为指导，研究者建议使用被广泛接受的“功效分析”工具来确定动物研究的池大小。假定平均值之间存在1.2倍差异，8.5 SD，I型误差0.05和功效80-95%，建议每组至少三只小鼠。实验必须至少进行两次，最好是盲法

• 考虑小鼠毛发生长的阶段也很重要，因为位于表皮 HF 结构中的 HF 干细胞 (HFSC) 可以促进 WH 动态。在毛发生长的活跃阶段，即“毛发生长初期”，HFSC 对伤口愈合的贡献越来越大，促进上皮再生的增加。因此，建议（除非另有要求）在 HF 在静止“休止期”阶段同步时进行实验。为了方便起见，第二个 HF 休止期可能是 WH 测定的理想选择，因为它为实验提供了相对较大的窗口。

• 值得注意的是，不同小鼠品系之间的 HF 周期时间不同，因此检查所用特定品系中的 HF 周期至关重要。在常用的 C57B 背景小鼠中，第二个休止期发生在7至11周龄之间，此时背侧 HF 在休止期同步。

• 最后，虽然雄性或雌性小鼠都可以用于实验，但使用雌性小鼠可能会具有优势，如“社会住房条件与个人住房”中所讨论的那样。理想情况下，小鼠应该是性别匹配的同窝小鼠；然而，也可以使用年龄和性别匹配的小鼠。

手术动物的准备

• 在进行实验之前，必须将指定区域的毛发去除。周围毛发的存在不仅可能会干扰伤口床，而且还可能使伤口的精确测量和成像变得困难。为了准备小鼠，应轻轻剃毛，并使用脱毛膏去除任何剩余的修剪毛发。至关重要的是，强烈建议不要通过拔毛的方式进行脱毛，因为此过程会损坏HFSC生态位，迫使HF进入激活生长期。

• 使用脱毛膏时必须小心，因为延长使用时间可能会导致化学灼伤和疼痛并改变愈合过程。为了最大限度地减少不良影响的风险，建议使用时间尽可能短（<30 秒）。脱毛膏通常是当地供应商提供的现成产品；因此，确切的应用时间必须由研究人员校准。可以通过用酒精垫擦拭该区域来去除霜，但这可能会导致体温流失并导致体温过低。为了防止这种情况，使用加热灯或加热垫维持体温至关重要。手术后，动物应适当休息≥1小时。

准备该程序的设备

• 当小鼠恢复时（脱毛步骤后），可以准备手术台和恢复笼。目标是最大限度地减少手术时间，从而提高动物的生存率。

• 恢复笼的准备：恢复笼应无菌且无垫料，研究者建议用 70%（体积/体积）乙醇喷洒和擦拭对高压灭菌的笼子进行消毒。垫料应更换为吸水垫或纱布垫，以保持小鼠温暖并吸收尿液。不建议让小鼠在没有任何填充物的情况下恢复；事实上，这种情况已被故意用来诱导小鼠产生压力。笼子地板上应放置5-10克标准或软（繁殖）食物，以方便动物喂养。此外，还应包括一个隐藏点和延长的水瓶尖端，以便于饮用。手术台的准备。手术区域必须消毒并用无菌手术吸水垫覆盖。

• 我们建议使用 70%（体积/体积）乙醇通过喷洒和擦拭的方式对工作区域进行消毒。还建议使用额外的消毒剂，例如 AntiGone。如果使用 AntiGone，请喷洒并等待1分钟，然后再擦拭该区域。手术工具应消毒并易于使用。在操作之前，验证O₂的可用性非常重要。

受伤区域的位置和标记

• 准确识别伤口部位是小鼠WH实验中的关键一步。事实上，伤口即使错位几毫米也会改变愈合过程并掩盖实验中的实际表型。特别是，小鼠背部皮肤的特点是地形不平坦，这使得精确定位受伤点变得困难。

• 为了确保可重复性，确定相对于脊柱背侧隆起的伤口区域至关重要。脱毛后通过触诊可以最准确地找到凸起，建议将其作为伤口的中心（图 2 a-e）。在这里，我们描述了直径为1厘米（0.785 平方厘米）的圆形伤口的技术。这可以通过使用1厘米活检打孔器的两步标记技术来实现。将打孔器轻轻压在皮肤上，留下可立即标记的完美圆形精细图案（图 2 f、g）。该技术保证了伤口放置的精确性，因为在标记和受伤步骤中，松弛的背部皮肤可能会折叠和拉伸。

• 值得注意的是，还可以使用1cm²模板生成方形1cm² 全层切除，将其放置在皮肤上并使用精细标记来定义要切除的皮肤区域。我们的经验表明，将伤口中心从凸起部分错位到亚凸起区域几毫米可能会导致愈合动力学的差异，从而损害数据可靠性。

图2| 面向凸出的 WH 测定的示意图：a.8周大的小鼠是背部伤口愈合实验的理想时间点；b.去除指定受伤区域的毛发。c和d.通过触诊两次确定隆起的大致位置。e. 凸出中心确定为头尾中线的横截面与凸出近似标记的平均纬度。f–h. 通过将 10 毫米活检打孔器与伤口中心 (f) 对齐，然后沿着图案 (g) 和伤口本身 (h) 进行精确标记，创建所需伤口形状的光图案。i.单独与配对饲养条件会影响伤口愈合过程以及数据完整性，因为大结痂可能会掩盖实际伤口大小。j.用透明尼龙片测量伤口面积。k.通过标准化初始伤口大小来进行伤口覆盖分析，以评估治疗组相对于对照组的伤口愈合动力学（示意图）。WH:伤口愈合。  

镇痛治疗

• 建议在受伤手术前给予初始剂量的丁丙诺啡（0.1 mg/kg）作为镇痛手段，随后的剂量每天两次，持续3d，包括受伤当天。

• 丁丙诺啡是一种合成阿片类药物，具有低毒性和与阿片受体高亲和力，在人类和许多动物研究模型中提供有效的止痛效果。为了尽量减少对伤口的破坏，在尾部皮下注射丁丙诺啡。如果每日两次注射不可行，可将阿片类曲马多 (0.1 mg/ml)添加到饮用水中，持续3天，作为疼痛管理的替代方法。

• 值得注意的是，丁丙诺啡缓释制剂（丁丙诺啡 SR-LAB）也可供使用，可将必要的止痛效果维持长达72小时。

制作伤口

• 制作伤口时，建议使用锋利、薄且弯曲的手术剪刀。所有手术工具在使用前均应适当消毒。

• 需进行初步切割，以使手术剪刀刺入皮肤下。之后操作者应沿着标记以长间隔精确切割，产生圆形切除，而不损伤下面的组织（图2h）。

• 最后，应轻轻地从动物身上取下切下的圆形皮肤以完成伤口。如果皮肤仍然与下面的筋膜相连，请轻轻切断靠近切除皮肤的这些连接。

受伤后的饲养条件

• 受伤后，应将动物迅速放入恢复笼内，并按上述方法预先准备。

• 为便于饲养和迅速恢复，可在笼底的食物颗粒上滴些水使其软化，并在伤后3d内加长水瓶尖。

• 受伤后1d，一旦伤口床干燥，应将小鼠转移到有常规垫料和丰富物的新笼子中。

• 重要的是，在伤口干燥之前将垫料或任何易碎的材料放入笼中可能会导致垫料纤维粘附并嵌入伤口中，从而影响愈合过程。

社会住房条件与个人住房

• 将小鼠单独饲养在单独的笼子中可能是防止笼子中的小鼠与彼此的伤口相互作用以及伤口重新张开的理想解决方案。然而，这种类型的住房在WH评估方面存在一些缺陷。首先，这种外壳解决方案可能会导致过大的结痂，并且收缩动力学可能无法准确反映潜在的WH过程，从而难以准确评估伤口大小。

• 相反，配对饲养的小鼠可以导致活跃的社交行为，即小鼠互相舔伤口并防止形成过大的痂（图2i）。经验表明，配对住房的好处（例如不会出现大痂）超过了伤口偶尔重新开放的风险。在这方面，建议将雌性小鼠成对饲养，以尽量减少伤口重新开放的发生，因为雄性小鼠与其他雄性小鼠一起饲养时更容易表现出攻击性。

• 然而，小鼠的攻击行为因压力、环境因素和社会动态等因素而异。因此，受伤后雄性的配对饲养是可能的，但需要仔细监测以评估任何潜在的攻击行为。如果雄性要配对，建议它们在实验前已经在笼子里交配。据报道，单独饲养的另一个缺点是小鼠的压力水平增加，这可能会影响伤口愈合等生理过程。

• 为了尽量减少笼中同伴之间的影响，我们建议将测试小鼠和对照小鼠成对饲养在同一个笼子中。在某些情况下，可能无法将小鼠成对饲养，或者如果研究人员有兴趣研究结痂形成，则可以将动物单独饲养。在这种情况下，建议增加每组小鼠的数量，以解释实验设计中变异性的增加。

• 总体而言，无法准确比较饲养在不同条件下的小鼠，得出的任何结论都必须谨慎对待。

伤口闭合分析：伤口测量和随访

• 伤口大小可以通过使用透明尼龙片或通过参考物体成像进行缩放来测量。一般来说，尼龙片方法很容易获得，考虑到背部皮肤的“地形”，并且需要廉价的设备（不包括扫描仪）。

• 然而，应该采取额外的精度，以方便准确标记伤口边界，并且进行技术重复（即对同一伤口进行重复测量）至关重要。相反，基于成像的测量很容易进行，但需要一致的成像设置和参考对象，以避免图像采集过程中发生的变化导致的偏差。

• 虽然这两种方法都是有效的，但在这里，我们描述使用尼龙片方法，该方法包括将片材轻轻地压在伤口上以覆盖伤口，在片材上标记伤口尺寸，并按照技术重复重复该过程两到四次（图2j）。40µm厚的尼龙片非常适合此用途，因为它们足够柔韧，可以贴合小鼠身体的轮廓。建议使用相同的尼龙片来同时测量治疗小鼠和对照小鼠。

• 此外，强烈建议在整个实验过程中由同一个人进行测量。通常，直径1厘米（圆形）或1平方厘米（方形）的伤口会在8-12天内愈合，并且可以随访长达30天以评估完全愈合。我们建议以1-2天的间隔进行测量，因为较长的间隔可能会错过伤口愈合的趋势（分辨率低）。然而，测量间隔应根据研究需要和预期治愈率来考虑。实验结束时，可以使用图像分析软件对标记的尼龙片进行分析。

• 对于基于成像的测量，应在Fiji等分析软件中处理图像，以计算伤口面积和每张图像中的参考对象。然后可以将伤口大小标准化为参考对象的计算面积。这样可以确定每天的伤口大小。由此产生的伤口尺寸可以通过使用Excel来进一步处理，以比较对照组和治疗组之间的 WH 趋势，类似于基于尼龙片的方法。

他莫昔芬诱导结合WH测定进行谱系追踪

• 将体内WH测定与谱系追踪实验相结合的可能性提供了前所未有的机会来研究伤口床上的不同细胞群如何协调其增殖、分化和迁移，以有利于受损组织的快速有效修复。多色荧光报告小鼠系，例如 Clevers 实验室开发的Confetti小鼠模型，允许通过使用含有荧光蛋白的转基因来标记和跟踪任何细胞类型（图 3）。这种插入Rosa26基因座且侧翼为FloxP位点的转基因的表达只能在他莫昔芬诱导的重组事件时被诱导。在floxed转基因小鼠中他莫昔芬诱导的Cre重组雌激素受体(ER)杂种(CreERT)酶的激活已广泛用于皮肤相关研究，以诱导所需的操作，例如荧光标记的敲除或组成型表达。ER部分的存在限制了Cre定位于细胞质，直到与激动剂结合。一旦给药，他莫昔芬可以微弱地结合并激活CreERT，但也可以在肝脏中进一步加工产生他莫昔芬衍生物、4-羟基他莫昔芬和艾多昔芬，这两种药物都显着增加了对 ER的效力。

• 然而，请注意，在许多情况下，成功重组需要多轮他莫昔芬注射，并且雌激素样化合物（例如他莫昔芬）可能会影响修复过程。相反，对于休止期 HFSC 等静止细胞或需要累积效应的情况，短追逐期可能不太重要。因此，我们敦促研究人员在设计实验时考虑这些参数。

• 值得注意的是，基于Cre的小鼠模型的诱导性并不限于他莫昔芬介导的激活。其他元件，例如截短的孕酮受体 (PR1)，可以与Cre蛋白融合以诱导活性(Cre-PR1)。在这种情况下，一旦PR1部分与其激动剂RU48677结合，就会发生激活。Cre-PR1模型已在多项研究中用于标记皮肤中的上皮细胞并研究它们在维持稳态和伤口愈合中的作用。无论选择何种诱导模型，如上所述，都应针对不同的实验设计仔细校准确切的浓度和给药程序。例如，神经嵴衍生细胞的标记必须在胚胎发生过程中进行。我们提供了进行他莫昔芬诱导的步骤，并辅以 WH 测定，该测定在我们手中已取得成功（BOX 1）。

图3| 谱系追踪的疤痕表皮整体的可视化

疤痕区域的整体制备

• 伤口完全闭合后，可以处死小鼠，并应仔细收获疤痕组织（包括新表皮）以及周围未受损的组织。请注意，应考虑与受伤相关的毛发周期激活的影响，因为受伤会在几天内触发周围伤口区域的 HF 进入毛发生长初期阶段。生长初期 HF 具有细长的结构，比休止期 HF58 更深入皮下组织。生长期 HF 的致密网状结构将表皮固定在真皮上，并且可能会阻碍表皮的分离以进行整体安装处理。因此，建议（如果可能）在受伤后进行相当大的恢复，以使伤口周围的 HF 恢复到休止期状态（受伤后约 30 天）。去除组织后，应轻轻刮掉真皮侧的脂肪，并将组织在 EDTA 等螯合剂中于37°C下孵育，以削弱表皮-真皮粘附力。然后可以在立体显微镜下手动分离组织。

• 固定剂，如多聚甲醛 (PFA)，可用于固定表皮组织。为确保组织平整，首先将样品调整、压平并铺在少量 PBS 中。在此阶段，可以吸出 PBS，并应在少量固定剂中孵育组织进行初始固定（15 分钟），以防止折叠。一旦“展开”的组织被固定，就会添加额外的固定剂来完成固定过程。大量洗涤后，可以执行标准染色程序，并且可以安装样品进行显微镜检查。值得注意的是，可以在完全愈合之前通过常规包埋在成型物质（例如石蜡）中并切片，然后进行标准免疫荧光、免疫组织化学或组织学染色来研究组织。组织学是评估 WH 过程的不同阶段和进展的强大技术。通过在显微镜下检查组织切片，组织学分析可以提供大量信息，包括细胞浸润的性质、细胞外基质的组织、发生的增殖（通过有丝分裂体）和细胞死亡。此外，整合上皮迁移、纤维化水平、肉芽组织范围和一般伤口床结构的组织学分析可用于加深对特定操作对组织重塑和修复过程的影响的理解。

图 4| WH实验的详细阶段。a.用电动剃须刀轻轻修剪毛发（0.5-1毫米长）。b.脱毛设备。c.在突出的伤口及周围区域涂抹一层厚厚的脱毛膏。d.确定伤口轮廓所需的设备。e.当鼠标侧卧时，通过触诊确定凸起位置。e’.在另一侧重复凸起位置确定。f.凸出中心确定在中线上的标记之间。g.将具有空心手柄的活检打孔器与凸出中心对齐。g' 和 g''用活检打孔器轻轻施加压力，以形成指定的伤口轮廓。h.精确标记伤口轮廓。i.受伤前在尾部注射镇痛药。j.初次切割时，用镊子轻轻按压并提起皮肤，垂直进行切割。k.将剪刀轻轻推过初始切口，以完成沿标记的切除。l和 l′凸出方向，1 厘米圆形伤口。m.放置尼龙测量片并包裹伤口。n.将伤口区域标记数次。(更加详细实验步骤请查看原文)

参考文献

Yampolsky M,Bachelet I,Fuchs Y. Reproducible strategy for excisional skin-wound-healing studies in mice. Nat Protoc. 2024;19 (1):184-206. doi:10.1038/s41596-023-00899-4