线粒体是产生维持细胞活动所需能量的细胞器，每个细胞大约有2000个线粒体，这些线粒体参与多个代谢途径，控制氧化还原稳态、信号传导、先天免疫和细胞凋亡等。近年来，线粒体研究已经成为国自然热点研究领域。本期，小橙子就为大家简单介绍线粒体功能常见的检测指标和方法。
图片来源于网络
线粒体是一种双层膜细胞器，外膜光滑，内膜明显折叠或呈管状，直径一般为0.5- 1.0 μm，呈棒状或者圆球状。形态学指标主要检测线粒体形态、数量、膜结构、线粒体是否出现肿胀等变化。
✅检测方法
🔥透射电子显微镜：进行线粒体结构和形态观察的金标准，包括线粒体大小、形状、线粒体嵴结构等；
🔥荧光观察：使用线粒体荧光染料（Mitotracker）对线粒体进行荧光标记（常用方法），然后使用荧光显微镜进行线粒体形态和分布分析。
🔥其他方法：原子力显微镜、AiryScan显微镜观察。
线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP, Δψm)指线粒体内膜两侧离子浓度不同所产生的负电位差(−180 mV ~ −200 mV)，与细胞动态平衡密切相关，反映线粒体功能的完整性，是评价线粒体功能的敏感指标。
✅检测方法
🔥荧光染料观察：常用检测方法，一般使用JC-1（最常用）、Rh123、TMRM、TMRE以及DiO6等荧光染料进行荧光标记，通过荧光颜色变化反应Δψm的变化或者线粒体去极化程度；
🔥FRET技术：供体FixD靶向并固定在线粒体上，受体LA为线粒体膜电位依赖的探针，通过FRET效率变化反应MMP水平；
Tips：关于FRET技术可回看文章《分子互作检测之——FRET技术》
🔥流式细胞术：使用荧光染料进行标记后使用流式细胞仪进行信号采集和分析。
Tips：线粒体膜上不同部位的MMP差异很大，精准测量局部MMP变化的方法仍在探索，目前发现低浓度的半花菁衍生物(TPP-CY)可以精确检测亚细胞水平的MMP和线粒体形态的微量变化，具有优异的选择性和高分辨率的特点。
线粒体耗氧率（O2 consumption rate，OCR）是单位时间内线粒体消耗氧气的速率，是线粒体功能重要评价指标。
✅检测方法
🔥Seahorse实验：通过测量细胞周围培养基溶解氧含量变化确定OCR（试剂盒包含寡霉素、鱼藤酮、FCCP和抗霉素A）。
🔥Stern-Volmer分析仪：添加氧分子探针，然后使用矿物油阻止空气流动，随后使用仪器检测并计算OCR；
🔥检测试剂盒：带有特异性氧气分子荧光探针的试剂盒进行处理，然后使用荧光酶标仪进行耗氧量测定并计算OCR；
Ca2+对于调控AKT生成至关重要，线粒体内Ca2+积累促进ATP合成，减少则降低ATP 水平，ATP合成受损进一步导致Ca2+失衡，最终导致线粒体功能障碍。
✅检测方法
🔥荧光探针法检测：使用荧光探针钙-罗丹明123对线粒体Ca2+进行标记，然后使用荧光分光光度计进行Ca2+浓度测定；或者使用荧光探针（Rhod-2、Fluo-3 AM、Fluo-4 AM、Indo-1 AM等）对Ca2+进行标记，然后使用共聚焦显微镜进行信号观察和分析；
Tips：Quin-2 AM、Fluo-3 AM、Indo-1 AM、Fluo-4通常用于标记胞内Ca2+；Mag-Fluo-4一般用于标记内质网Ca2+；Fluo-3能够用于定量分析单个活细胞中Ca2+分布并区分线粒体Ca2+；
🔥其他方法：沉淀法、电化学法、EDTA螯合滴定法、火焰光度法和原子吸收分光光度法等。
线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，具有高度选择性，是调控线粒体通透性的结构基础。MPTP适度开放可促进线粒体清除有害物质，持久开放则会导致不可逆损伤，诱导线粒体基质肿胀、内膜去极化、ATP水解等，最终导致细胞死亡或凋亡
✅检测方法
🔥钙黄绿素-钴荧光探针检测：使用钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein AM）染色细胞，通过荧光信号评估MPTP开放性；（常用方法）
Tips：Calcein（绿色荧光）在生理pH条件下和Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe3+和Mn2+等金属离子络合时，荧光信号会发生淬灭。
🔥膜片钳检测：通过记录离子通道电流评估离子通道活动，评估线粒体功能；
🔥其他方法：分光光度法及活性物质标记法等。
线粒体是ATP的主要产生场所，ATP水平是评估线粒体功能关键指标。
✅检测方法
🔥ATP检测试剂盒：根据萤光素酶催化萤光素产生萤光需要ATP的原理，通过测定萤光产生检测溶液中ATP浓度；
🔥荧光探针法：使用Mito-Rh探针，高选择性的实时监测线粒体中ATP含量变化，灵敏度可达0.1-10 mM；
🔥FRET法：以AT1.03蛋白为底物，N端和C端分别带mseCFP△C11青色荧光蛋白和cp173-mVenus黄色荧光蛋白，在结合ATP后，AT1.03蛋白构象发生变化变化并产生FRET现象，通过FRET效率评估ATP浓度；
Tips：关于FRET技术可回看文章《分子互作检测之——FRET技术》
🔥其他方法：经典层析法、高效液相色谱法和酶分析法等
线粒体呼吸链复合体是一组相互协同的蛋白质复合体，位于线粒体内膜，主要功能是将食物分子转化为能量，同时清除体内过多的自由基，维护机体免受氧化损伤。线粒体呼吸链复合体检测对于生物体内能量代谢和抗氧化过程的研究具有重要意义。
✅检测方法
🔥分光光度法：NADH的氧化速率与复合物I和V的活性成正比，因此可以通过检测NADH在340 nm处的吸光度评估检测复合物I和V的活性；复合体II催化琥珀酸氧化，以DCPIP为底物，测定底物氧化后 600 nm 处吸光度值能够确定复合体II的活性。复合体III和IV的活性主要通过测量细胞色素在550 nm处的吸光度来确定。
🔥Western blot：通过WB检测呼吸链复合体I-V的蛋白表达水平，评估呼吸链状态；
线粒体是细胞内氧化磷酸化和产生ROS的主要场所，ROS 可导致mtDNA碱基氧化和增殖异常，从而引起线粒体ATP合成减少和MMP下降， ROS水平能够反应线粒体功能和状态。
✅检测方法
🔥荧光染色：使用靶向线粒体的荧光探针MitoSOX Red、Mito-Tracker Red CMXRos标记ROS，然后使用共聚焦显微镜或者流式细胞仪进行检测和分析；
🔥其他方法：化学发光法、电化学生物传感器以及分光光度法等。
MtDNA是线粒体DNA，其拷贝数也能用于评估线粒体功能和状态。
✅检测方法
🔥免疫荧光：使用Picogreen荧光或SG-ALK染料特异性性标记DNA，使用DeepRed-Mito或者MitoTracker染料标记线粒体，荧光显微镜观察并分析线粒体中mtDNA含量；
🔥mtDNA和线粒体共标记：使用mtDNA抗体（TFAM或者抗DNA抗体）和线粒体标记抗体（TOMM20）对mtDNA和线粒体工标记，荧光显微镜观察并分析mtDNA数量；
🔥其他方法：使用qPCR或者NGS测序等直接测定mtDNA含量；
