一、Transwell实验概述

Transwell实验是体外研究细胞迁移和侵袭能力的经典方法，在肿瘤转移、免疫细胞趋化、药物筛选及细胞间相互作用等领域用得非常广泛。

它的核心思路是用一张多孔膜把上下两个腔室隔开，模拟细胞在趋化因子梯度驱动下的跨膜运动。

二、实验原理

把Transwell小室想象成一个带滤网的双层漏斗，逻辑其实特别简单。

上层是细胞出发的"起点"，下层藏着它们渴望的"诱饵"——通常是加了血清或特定趋化因子的培养基。细胞天生会朝营养更丰富、信号更强的方向跑，这种本能驱使它们穿过中间那层布满微孔的聚碳酸酯膜（孔径范围0.4–8 μm），从上层钻到下层。

这里最容易让人犯迷糊的，是"迁移"和"侵袭"到底差在哪。

迁移实验评估的是细胞的定向运动能力；侵袭实验则需要额外包被基质胶（如Matrigel）来模拟细胞外基质（ECM），看细胞能不能降解基质、穿透膜。

实验最后，把穿过去的细胞固定、染成深紫色，在显微镜下数个数。穿过去的越多，说明这群细胞要么跑得欢，要么"啃"得猛，数据就这么直观地出来了。

三、实验材料

这里有个极易被忽视的细节：Matrigel对温度极度敏感，必须-20℃保存，使用前需提前一晚移至4℃缓慢融化。切忌室温解冻或反复冻融，否则成胶不均，后续铺膜全是徒劳。

四、实验步骤

（一）铺胶（仅侵袭实验需要）

如果你做的是侵袭实验，铺胶就是生死线。

全程冰上操作，枪头提前预冷。用预冷的无血清培养基把Matrigel稀释好，每个小室加50–100 μL，动作要轻，别让胶沾到侧壁上。加完立刻水平放进37℃培养箱，静置3小时，等它彻底凝固变硬。

手别抖，让胶体自然流平。

（二）制备细胞悬液

铺胶等待的时间正好同步处理细胞。挑状态最好的对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化，看到细胞变圆收缩马上终止。1000 rpm离心3分钟，弃上清，用PBS洗一遍——这步是为了去掉残留血清和死细胞碎片，别偷懒跳过。最后用无血清培养基重悬，调整密度至1×10⁵ cells/mL。

密度一定要调准。太密了细胞挤在一起穿不过去，太稀了镜下数不到几个，数据没法看。

（三）接种细胞

先在24孔板的下室加入500 μL含10% FBS或趋化因子的培养基——这是给细胞画的"大饼"，引诱它们往下跑。再用镊子夹住小室边缘垂直放入孔板，确保膜面完全浸没且没有气泡。往上室轻轻加入200 μL细胞悬液，注意枪头不要戳破基质胶。

放进培养箱，培养24小时。

（四）染色与计数

1. 擦拭上室： 取出小室，用棉签伸进上室，把膜上面没穿过去的细胞和残留的胶轻轻擦干净。这一步要温柔但果断——擦不干净，背景会黑成一团。

2. 固定： 把小室放进含600 μL 4%多聚甲醛的新孔里，室温固定30分钟。

3. 染色： 固定好后移到预先加了约800 μL 0.1%结晶紫的孔中，室温染色20分钟。取出后用PBS轻柔清洗2次，洗掉浮色。

4. 计数： 显微镜下别只盯着中间看，随机选上、下、左、右、中央共5个视野拍照计数，呈紫色的即为穿膜阳性细胞。这样算出来的平均值才靠谱。

五、注意事项

标准流程照着做了，数据还是惨不忍睹？问题往往藏在那些说明书没细写的操作细节里。

铺胶的气泡问题。 吸取胶液时动作要轻缓，千万别为了排空把枪头怼到孔底，那样极容易卷入气泡。膜上一旦出现气泡，细胞就会在那儿堆积，后续计数根本没法看。

擦拭的力度问题。 用棉签清除上室细胞时，力度要像抚摸一样轻柔，垂直向下轻轻滚动带走细胞就好。聚碳酸酯膜其实很脆，稍微来点横向力道或按压过重，膜就破了，前面的活白干。

饥饿处理别跳过。 很多教程直接让你消化接种，但如果细胞在富营养状态下长得太欢，迁移数量的增加可能只是因为疯狂分裂，而不是真的"跑"得快。建议接种前用无血清培养基让细胞饿上12–24小时，把增殖带来的背景噪音降下来，测出来的才是细胞真实的运动能力。

六、常见翻车现场及急救方案

结果不理想，先别急着怪细胞"不听话"，逐条排查一下。

翻车现场一：膜面干干净净，一个细胞都没有。

别光顾着延长培养时间。回头想想：上室的细胞状态本来就不好？无血清饥饿处理过头把细胞"饿死"了？下室趋化因子浓度够不够？有些因子半衰期短，配好放久了就失效了。都排除了的话，再看看膜孔径选得对不对——大细胞硬要钻小孔，累死也过不去。

翻车现场二：染色后背景一片紫，分不清哪个是细胞。

大概率是结晶紫浓度太高，或者最后PBS清洗太敷衍。洗的时候水流要轻柔但得彻底，直到流下来的水变清为止。

翻车现场三：细胞在膜上聚成一团团，分布极不均匀。

多半是接种前细胞悬液没吹打散开，或者放入小室时手抖碰歪了导致液面不平。操作时尽量保持孔板水平，加样后轻轻晃动几下让细胞自然沉降，别让它全堆在中间。