微生物的分离，说白了就是把你想要的那株菌从一大堆"乌合之众"里单独挑出来。这是微生物实验最基础、也最考验手感的操作。
常用的微生物分离培养方法主要三种：划线分离法、涂布平板法和倾注平板法。后两种还能顺手把菌数算出来。今天我们把这三种方法从原理到操作技巧一次讲透，争取帮你从实验室小白一路进阶到分离培养老手。
一、划线分离法
1. 原理
思路很朴素：用接种环在固体培养基表面把菌"越划越稀"，稀到某些位置只剩下单个细胞，培养出来就能长成一个个独立的单菌落。你追求的不是"划得满不满"，而是单菌落多不多、干不干净——后续挑单克隆、做保藏、做鉴定全靠它。
2. 操作步骤
(1) 取菌种： 如果是甘油管，外壁用75%酒精擦干净，等酒精完全挥发后再开盖。开盖和操作尽量靠近酒精灯火焰一侧，别在台面中间慢慢拧。
(2) 接种环灭菌： 这一步不要省，直接烧到发红——要烧红！要烧红！要烧红！ 烧不红杀菌不彻底，污染来的时候你还以为是"菌长得杂"。
(3) 冷却： 烧完别急着蘸菌。最实用的判断方法：把接种环在平板内侧边缘或不会用到的区域轻点一下，培养基不融化就说明温度差不多了；一点就化，继续在火焰旁晾几秒。
(4) 蘸取菌种： 甘油管口在酒精灯火焰上略微过一下（别烤糊），用冷却好的接种环蘸取一环菌种。
(5) 划线： 平板盖子只掀开一条缝，开口朝酒精灯。第一段在一侧连续划3–4道，把菌先铺开；接种环再烧红、冷却后，从第一段末端"带一点点"到第二段，再划3–4道；同样方法做第三段。菌浓度高的可以加到第四段，具体几段看菌液浓度和菌种类型。
(6) 标记： 在平板底部边缘写清菌名、日期和操作者信息。
(7) 培养： 倒置放入恒温培养箱。
(8) 保存： 培养完成后转存4℃冰箱备用。
3. 操作技巧
甘油管别反复冻融。 取一次尽量用完或分装，来回冻会让活性掉得明显，后面怎么划都像"没长"。
提前判断菌浓度。 如果你发现第一段就糊成一片，别硬划到底。回头先评估浓度：翻翻实验记录、显微镜看个大概，或者测一下吸光度，心里有数再决定划几段。有三种方法可以参考——查记录、镜检粗估、测OD值，根据条件选一个就行。
学会"扫尾"。 想让末端更容易出单菌落，可以在最后一段顺手拉几条长线，别在一个小区域里来回蹭。尾巴越干净，单菌落越漂亮。
不过说实话，实际操作中很少有人严格扫尾——有时候根本看不清尾部在哪，直接在附近空白区域划线，效果也不差。
一定写清标记。 这话听着像废话，但实验室里"忘了标""标错了"的惨案比你想象的多。
4. 注意事项
- 除样品外，所有操作必须在无菌环境下进行，打扫卫生和消毒时做好个人防护。
- 实验结束把无关物品从超净工作台取出，该灭菌的灭菌后再处理，防止交叉污染。
- 操作过程中尽量减少人员流动，避免手部接触平板边缘。
- 真遇到酒精灯引燃的小意外，湿抹布覆盖闷灭就行，别端着火跑。
二、涂布平板法
涂布平板法好用的地方在于：它既能把混在一起的微生物"拆开"长成单菌落，也能顺手把数量算出来。前提是你得先把样品稀释到"能数得清"的程度。
1. 原理
样品经过一系列10倍梯度稀释后，取一定量涂布到固体培养基表面，经适宜条件培养后形成单菌落。既能获得纯培养物，也能进行平板计数。
2. 操作步骤
梯度稀释：
(1) 称量： 准确称取待测样品1 g或量取1 mL。
(2) 稀释： 放入装有99 mL无菌生理盐水（加小玻璃珠）的250 mL三角瓶中，记录。
(3) 摇匀： 上摇床振荡30 min，让微生物细胞充分分散，静置20–30 s，得到10⁻²稀释液。
(4) 继续稀释： 用1 mL无菌移液器吸取上述稀释液1 mL，移入装有9 mL无菌水的试管中，吹吸3次混匀，得到10⁻³稀释液。换一支枪头，同样操作得到10⁻⁴……以此类推，做到10⁻⁷、10⁻⁸、10⁻⁹等。
很多人翻车不在涂布，而在稀释——每一次取样前都要把管子或瓶子摇匀、吹吸混匀，别嫌麻烦。没混匀的话，你以为自己在做10倍稀释，实际是在做"随缘稀释"，后面平板长成什么样完全看运气。粉末、颗粒样品更要舍得用玻璃珠，振荡或充分摇动，让附着在颗粒表面的菌被"洗"下来，不然局部一坨，计数也不准。
涂布平板：
(1) 标记： 事先在无菌平板上标好10⁻⁷、10⁻⁸、10⁻⁹，每个梯度设三个重复。
(2) 涂布： 用无菌移液器分别吸取对应稀释液0.1 mL加到平板表面，用无菌涂布棒轻压贴着培养基表面推开，可以画"8"字或转盘式，目标只有一个：薄、匀、别划破琼脂。每个稀释度换一根涂布棒，用完灼烧灭菌。枪头也勤换，避免把10⁻⁷的菌带到10⁻⁹里，白稀释了。
(3) 静置： 涂完别急着倒置。先把平板平放静置10分钟，让液滴渗进培养基；直接倒置的话，液体容易流到一侧，菌落分布会很难看。
(4) 培养： 倒置放入恒温培养箱。
(5) 计数： 长出菌落后即可计数。
(6) 保存： 单菌落平板4℃保存备用。
3. 计数原则
挑菌落数在30–300的平板，既不至于太少误差大，也不会太多挤在一起数不清。
- 只有一个稀释度落在这个范围，就用"平均菌落数 ÷ 0.1 mL × 稀释倍数"换算成原样品浓度。
- 如果有两个相邻稀释度都合格，比较两者菌落总数之比：比值小于2，取两者平均值；比值大于2，取较小的菌落总数。
4. 操作技巧
前几个稀释梯度适当放大倍数， 尤其是第一个梯度。这样不容易丢失目标菌，也能更好地溶解样品。
利用显微镜粗略估测。 并不是每个样品都需要稀释到10⁻⁹，根据样品中微生物的数量来定。
平板表面水分很影响手感。 太湿容易推成"水膜"甚至长菌苔，建议提前一两天倒平板或适当晾干到"表面无明水、摸起来还有点润"的状态。耗材本身稳定——移液器刻度准、涂布棒成型好——也能明显降低人为误差和污染率。
5. 注意事项
三、倾注平板法
1. 原理
稀释好的菌液不再涂在表面，而是直接和"还没凝固的琼脂培养基"混在一起再倒进培养皿里。菌体被封在培养基的不同深度，培养后上下都会长菌落，所以它更像一个计数工具，用来估算样品里微生物的数量很顺手。但也正因为菌落有一部分埋在胶里，后续想把每个单菌落都挑出来做纯化，会比涂布法麻烦。
2. 操作步骤
梯度稀释：
同涂布平板法。
倾注平板：
(1) 制备培养基： 固体培养基高压灭菌后放在恒温水浴锅中保温备用。别丢在台面上等它"自然冷却"，很容易出现瓶口先结一圈、里面还很烫的尴尬，倒出来全是小凝块。
(2) 标记： 在无菌培养皿上标好10⁻⁷、10⁻⁸、10⁻⁹，每个梯度三个重复。
(3) 倾注： 培养基冷却至合适温度后，用无菌移液器吸取对应稀释液0.1 mL加入培养皿中，再倒入融化的培养基，轻轻混匀。也可以先把稀释液加入培养基中混匀再倒入培养皿，根据你的习惯来。
(4) 凝固与培养： 平放于超净台上静置至凝固，然后倒置放入恒温培养箱培养。
(5) 计数： 长出单菌落后计数，计数原则同涂布平板法。
3. 操作技巧
温度把控是倾注法最容易翻车的点。 太热会把菌"烫没了"，太冷又混不匀、倒不平。实验室里有个很实用的土办法：用手背贴一下瓶身，手心不烫、手背觉得烫，基本就是50℃上下，这个区间通常比较安全。不同菌种耐受不一样，但一般40℃左右培养基就会开始凝固，别拖太久。
混匀别用力摇。 沿着培养皿壁画圈晃动几下就够，让菌液和琼脂融合就停。气泡一多，菌落被泡泡"切碎"，后面数到怀疑人生。
离心管代替长试管。 想让稀释更省事，可以用离心管来做梯度稀释，上下颠倒更容易混匀。但不管用什么容器，全程无菌别松懈。
水浴锅里的培养基要隔一会儿轻轻摇一摇， 防止局部先凝固。
无菌水用生理盐水， 保护细胞完整性。
为了涂布均匀平整， 有时候需要事先在培养皿底部倒一薄层培养基打底，也就是"双层平板"的做法。
4. 注意事项
四、涂布平板法和倾注平板法怎么选？
两种方法前半段几乎一样——都得先把样品做梯度稀释，把"挤在一起"的细胞尽量拆开。拉开差距的是后半程。
涂布法： 平板先凝固好，你再把稀释液点到表面用涂布棒推开。菌落基本都长在表面，挑起来干净利落，后续做纯化、保藏、复筛都很方便，而且不需要纠结培养基温度。代价是手上功夫要稳——涂不匀就容易一边密一边稀，甚至被涂出"菌苔"，计数跟着翻车。
倾注法： 稀释液和还没凝固的培养基混匀后一起倒进培养皿。少了涂布这一步，均匀性往往更好，新手也不容易因为手抖把平板划伤。但它对温度更挑剔，而且菌落有一部分长在培养基内部——计数没问题，想完整挑出来就不太友好。
简单选法：要挑单菌落选涂布，要计数省心选倾注。
分离培养技术看似简单，实则暗藏玄机。每一次划线的力度、每一个温度的感知，都需要在反复实践中打磨。
