1 实验概述

提到细菌克隆形成单位（CFU），很多新手第一反应就是"数菌落"。没错，但它的价值远不止一个数字。

在科研和临床的实际场景里，CFU更像一把多维度的标尺。最基础的用法是定量——统计平板上长出的单菌落，直接换算出样本中的活菌总数，食品污染评估和环境微生物监测都离不开它。

再进一层，CFU能敏锐地反映细菌的"生命力"。药物筛选实验中，对比给药前后的CFU变化，就能直观判断抗生素是不是真的杀灭了细菌，还是反而诱导出了耐药性。

更有意思的是，通过比较不同培养条件下的CFU情况，还能摸清病原体的生长"脾气"——它喜欢什么温度、什么pH、什么营养环境，一目了然。

在免疫学领域，CFU的应用尤其广泛。研究人员经常用巨噬细胞吞噬实验，检测胞内残留的CFU数量，以此量化免疫细胞的杀菌效能和细菌的存活率。临床上也能用它检测痰液等样本中的病原菌种类和数量，筛查耐药菌株。

下面就以巨噬细胞吞噬分枝杆菌为例，把CFU实验的完整步骤和关键注意事项拆解一遍。

2 实验步骤

2.1 准备工作

（1）实验器材和试剂

常规耗材：无菌培养皿、移液器、吸头、恒温培养箱（37℃）。

培养基的选择得看你养的菌：普通大肠杆菌用LB就行，分枝杆菌这类"慢郎中"得换上Middle Brook 7H10固体培养基。此外，0.1% TritonX-100裂解液、无菌PBS，以及抗生素（氨苄青霉素、两性霉素B、羧苄青霉素等）也要提前备齐。

（2）倒平板

培养基高压灭菌后别急着倒。手背贴一下瓶壁，感觉温热不烫手（大约50~60℃）再进超净台操作。每个培养皿倒入15~20 mL，轻轻晃动让底部铺匀，静置等培养基凝固。一张平整的"画布"，这就算准备好了。

2.2 细胞感染与CFU测定（以巨噬细胞吞噬分枝杆菌为例）

（1）接种细胞

在6孔板里铺上1×10⁶个/孔的巨噬细胞，放入37℃、5% CO₂培养箱培养24~48 h，等细胞贴壁长好。

（2）实验干预与感染

根据实验设计加入不同浓度的药物处理细胞，随后以MOI=10的比例进行细菌感染。

> 小贴士：什么是MOI？
> MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）指感染时细菌与细胞数量的比值。MOI=10意味着细菌数量是细胞数量的10倍。比如孔里有100万个细胞，就需要投入1000万个细菌，保证每个细胞都有足够概率被感染。

（3）细菌CFU测定

感染处理：

感染4 h后，用1×PBS洗涤细胞3次，洗掉游离菌，加入含5%青霉素-链霉素混合溶液的培养基杀灭胞外菌，只留下钻进细胞里的细菌。重新孵育6 h后，换回不含青霉素-链霉素的培养基，让细胞继续"消化"细菌24 h。

到了收获时刻：PBS再次洗涤细胞，加入0.1% TritonX-100裂解15 min，把巨噬细胞膜打破释放胞内细菌，随后加完全培养基或PBS终止裂解。收集至2 mL离心管，200 rpm振荡10 min混匀，2000 rpm离心3 min收集沉淀，1 mL完全培养基重悬。

这时候你手里拿到的，就是一管包含胞内幸存细菌的悬液。

梯度稀释：

为方便操作，先将菌母液移装至5 mL EP管。另取9支EP管，编号1~9，每支装入900 μL无菌PBS。

从菌母液中吸取100 μL加入1号管，涡旋振荡混匀，得到10⁻¹稀释液。再从1号管吸取100 μL加入2号管，混匀后得到10⁻²稀释液。以此类推，一直做到10⁻⁹。

这里有个关键动作：每次加完菌液后，必须充分涡旋混匀。 任何一次混匀不到位，后续浓度都会呈指数级偏差。

涂布培养：

取稀释好的菌悬液50~100 μL，涂布到培养基上。分枝杆菌需要在37℃培养箱中培养3~4周。

培养期间定期观察，找到菌落密度适中、互不重叠的稀释梯度，选定后进行二次涂布验证。

CFU计数与计算：

生长状态正常的平板，可以直接肉眼计数或借助菌落计数器辅助。以3份重复为一组计数，取平均值。

需要注意的是，菌落密密麻麻数不清，说明稀释倍数不够；平板上几乎没有菌落，则可能稀释过度或细菌活力受损。只有选到那个"黄金区间"的平板，数据才有意义。

如果CFU数量越少，说明实验干预增强了对细菌的杀伤；反之则提示干预促进了细菌存活。

计算公式：

原菌液浓度（CFU/mL）= 实际菌落数（CFU）÷ 取样体积（mL）× 稀释倍数

举个例子：在10⁻⁶的平板上数到150个菌落，涂布量0.1 mL，那么原液浓度 = 150 ÷ 0.1 × 10⁶ = 1.5 × 10⁹ CFU/mL。

前面的稀释做得越规范，这个公式算出来的结果才越可靠。

3 注意事项

（1）无菌操作贯穿始终。 从打开超净台风机那一刻起，手套、口罩、实验服就得穿戴整齐。任何暴露在空气中的多余动作都可能引入杂菌，让后续计数全部白费。

（2）稀释环节是误差的重灾区。 移液器的校准不能只靠感觉，吸取菌液后务必涡旋振荡充分混匀，确保细菌真正均匀分散，否则算出的浓度可能偏离好几个数量级。

（3）涂布棒灭菌后别急着碰平板。 酒精灯灼烧后的涂布棒温度很高，先在培养基边缘空白处停留几秒降温，避免余热直接"烫死"细菌。

（4）涂布讲究手感。 推棒时力度轻柔均匀，配合手腕转动培养皿，把菌液铺满整个平面。注意别划破琼脂表面——一旦划出沟壑，菌落会顺着裂痕连成一片，根本没法分辨单个克隆。

（5）计数别只看"最好看"的那一个板。 肉眼看走眼是常事，借助放大镜或自动计数器能减少视觉疲劳带来的漏计。对同一稀释度的多个平板取平均值，比单凭一块板子下结论靠谱得多。

（6）注意个人防护。 尤其是操作分枝杆菌等病原微生物时，实验服、口罩、手套缺一不可，必要时在生物安全柜中操作。