A gentle palette of plasma membrane dyes

温和型细胞膜染料

论文信息：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，IF：9.3，https://doi.org/10.1073/pnas.2504879122

主讲人：刘梦月，2025年8月17日

研究进展 or 研究背景：

作为分割细胞与外界环境的屏障，细胞膜参与物质运输、信号转导、细胞识别等生理活动。实时观测细胞膜形态及其动态变化对细胞生物学及发育生物学等领域具有重要意义。荧光成像作为一种实时非入侵式的观测手段，已经成为了研究细胞膜的重要工具。近年来，荧光成像逐渐从宽场和共聚焦向超分辨和长时程成像转变，希望以前所未有的时间和空间分辨率检测细胞膜形态及动态变化。然而，这对细胞膜染料的光物理和光化学性质提出了更高的要求。在超分辨和长时程成像中，过强的激发光和过长的曝光时间会导致明显的光毒性"灼伤"细胞和光漂白"吞噬"信号。因此，传统的细胞膜染料难以长时间对细胞膜的生理状态进行观测，无法满足细胞膜成像对超高时空分辨率的新要求。

研究意义与目的：

报道了一系列温和细胞膜探针，具有优异的光稳定性和显著降低的光毒性，在不诱导内吞的无血清成像液中可以实现对癌细胞系和多种原代细胞的STED及SIM超分辨成像以及对神经、生殖等细胞运动及发育过程的长时程追踪。

解决方案 or 研究内容：

基于三线态淬灭剂偶联策略，将三线态淬灭剂COT、荧光母核花青与两亲性膜定位基团整合为新一代低光毒性细胞膜染料PK Mem。与商用细胞膜染料MemGlow相比，同波段的PK Mem单线态氧量子产率降低了56-77%，光稳定性提高了1.3-3.1倍，更适用于长时程成像。该系列染料不仅可以标记HeLa、KB等细胞系，也可以对小鼠胚胎干细胞、大鼠海马神经元、精子和成熟心肌细胞等原代细胞的精细细胞膜结构以及小鼠脑片和活体神经元染色。

长时程活细胞成像常面临光毒性引发的细胞膜起泡及细胞死亡等难题，极大地限制了对细胞膜形态以及迁移、收缩、发育等动态过程的深入观察。PK Mem由于具有显著降低的光毒性和增强的光稳定性，成功实现了多种细胞类型中细胞膜的长时程活细胞成像。研究团队以HeLa细胞为模型，对比PK Mem 555与MemGlow 560标记下的细胞膜成像，PK Mem 555显著延缓细胞起泡时间，表现出更低的光毒性，其他波长的PK Mem dyes亦具有类似优势。高通量成像和细胞存活率检测进一步证实PK Mem染料有效减少长时程成像引起的光损伤。

在神经元领域，细胞膜的精细动态过程如生长锥的扩展与收缩、轴突的导向和分支，对于神经发育、回路重塑及神经再生至关重要。传统的膜染料在长时间、高频率成像中常因光毒性导致 神经元损伤，严重限制了对这些动态过程的深入观察和研究。PK Mem 555在轴突生长锥成像中展现出碾压性优势。相比传统染料MemGlow 560（引发88±11%生长锥坍塌），PK Mem 555在20分钟高时空分辨率成像（2秒/帧）下实现零光毒性损伤，还可以精准捕捉丝状伪足动态（0.25秒/帧）。

此外，显著提高的光稳定性使PK Mem成为了一款性质优异的超分辨成像染料。PK Mem 590的光谱与775 nm的STED光完美匹配。在STED显微镜下，可以在小于100 nm的分辨率下清晰地观测到心肌成纤维细胞的迁移体以及小鼠海马神经元的轴突和树突棘等微小结构，并实现神经元生长锥超过10张的STED延时成像。通过与低光毒性线粒体染料PK Mito Deep Red共染，可以通过SIM超分辨长时（>7 h）成像观测神经元轴突内的线粒体运输过程。

总结与展望：

综上，研究团队基于三线态淬灭剂偶联策略开发了新一代细胞膜染料PK Mem，具有显著降低的光毒性和提高的光稳定性，适用于STED及SIM超分辨长时程观测细胞膜的精细结构与多种质膜生理活动，可以与其他染料或抗体联用，对细胞膜形态及动态变化进行超高时空分辨率成像。尤其是在神经元成像中展示出卓越性能，仅需20 nM就可以清晰标记树突棘形态，并支持生长锥延伸与线粒体运输的超分辨动态追踪。PK Mem系列有望成为超分辨时代细胞膜成像领域新标准试剂。